srijeda, 9. veljače 2011.

od talasmenije dalje


TALASEMIJE:
-ime izhaja iz grške besede »za morje« kjer so jo prvič opisali pri preb.iz mediteranskega okolja. Visoka pogostost talasemije je posledica zaščitnih učinkov proti malariji, ki jih nudi nosilcem-molekularni mehanizem še ni znan. Nastanejo zaradi nezadostne tvorbe Hb in neuravnovešenega nabiranja globinskih podenot. Mutacija lahko vodi v nefunkc. verigo alfa in beta: nezadostno proizvajanje Hb povzroči hipokromijo in mikrocitozo. Funkcionalne verige ki se tvorji pri normalni hitrosti predstavljajo problem, ker je v relativnem presežku. Neravnovesno nabiranje nefunkcionalnega Hb povzroči infektivno eritropoezo in hemolitično anemijo. Talasemije so bolj razširjene pri ljudeh. Ki izhajajo iz mediterana, Afrike,srednjega vzhoda,Indije,Kitajske in J.Azije
-alfa talasemija: od 0,01% v ZN, Islandiji in na Japonskem, do 49% pri preb.nekaterih JZ Pacifiških otokov. Gre večinoma za delecije na področju krom.16; »hidrops fetalis« ali homozigotna alfa-talasemija(general. Edem plodu zaradi inkompatibilnosti Rh matere in plodu.
-beta talsemija: od 1,5% pri Afričanih in afriških Američanih do 30% v nekaterih vaseh na Sardiniji in Cipru. KS: padec beta globina povzroča hipokromno, mikrocistično anemijo in neravnovesje v sintezi globina, kar vodi do precipitacije alfa verig ki so v presežku. Beta globin ni nujno potreben med življenjem ploda, tako se beta talasemija ne pojavi do nekaj mesecev po rojstvu. Izrazite ličnice in izrazita zgornja čeljust sta rezultat ekspanzije mozgovne votline lobanjskih in obraznih kosti-posledica infektivne eritropoeze. Transfuzijska terapija vodi pri obeh vrstah talasemij do preobremenitve z Fe. Beta talasemija je ponavadi posledica zamenjave ene baze (raje kot delecija). Ta mutacija se zgodi v promotorju, kar vpliva na izrezovanje in mRNA. Posledica je prehitro tvorjenje globinskih verig.
ALPORTOV SINDROM IN HEMATURIJA
-Zgodnji pojav: končna ledvična odpoved pri mlajših od 31 let, x-vezano(COL4A5), avt.rec (COL4A3-4),avt.dom.,homogenost znotraj družine. Kasnejši pojav:končna ledvična odpoved pri starejših od 31 let, x-vezano,avt.rec.,avt.dom., heterogenost znotraj družine.
-mutacija COL4An(n=3,4,5), ni pravilnega kolagena IV.(ledvice,oči), incidenca 1/5000 do 1/10000, ultrastrukturne nepravilnosti v GBM
-dedna nefropatija (Alport opiše družine z družinskim nefritisom s poudarkom na opisu gluhosti; ledvična odpoved); očesne nepravilnosti (antenor leuticonus, retinopatije, distrofije roženice)
-znaki: hematurija, proteinurija, progr.visokotonska senzorinevralna gluhost; elektronska mikroskopija bazalne membrane.
-gen.analiza: bolnih, DNA izoliramo iz periferne krvi, pomnožitev 51 eksonov COL4A5 z PCR, analiza z SSCA-PCR, pomnoževanje 52 eksonov COL4A4 ter 48 eksonov COL4A3 z PCR, analiza z SSCA-PCR, sekveniranje.









Bolezni tripletnih ponovitev
FRAGILNI X-SINDROM
-X-vezano dominantno dedovanje z zmanjšano penetranco, prizadeti v glavnem moški,
-srednja do težka umska prizadetost, hiperelastičnost sklepov,velika ušesa, veliki testsi, umska prizadetost(IQ20-60),problemi koncentracije/hiperaktivnost,avtistično vedenje; PREMUTACIJE: MOŠKI: nevrološke disfunkcije pri 50-60letih, tresenje rok, ponavljajoče se ataksije, rahlo zmanjšanje kognitivnih sposobnosti. ŽENSKE: možne rahle kognitivne in vedenjske motnje,zgodnja menopavza.
-na kromosomih vidna prekinitev na X kromosomu:Xq27.3, citogenetsko se ga da določiti le na nekaterih metafaznih celicah(pod posebnimi pogoji z dodatkom timidina in pomanjkanjem folatov)
-FMR-1 = gen za fragilni X sindrom
-CGG ponovitve v eksonu na 5' koncu gena, polna mutacija je vezana z metilacijo CpG otokov FMR1gena
-odsotnost FMRP proteina je odgovorna napaka, ki povzroči fenotipske znake FMR-1
-variabilno število CGG ponovitev:-normalni moški in ženske 6-54(povp30) kopij CGG,-normalni moški prenašalci in normalne ženske prenašalke 60-200kopij CGG (povp140),-ekspanzija trinukleotidnih ponovitev med maternelno mejozo vodi v obolelost pri sinovih in hčerah.
-odkrivanje: Southern blot, PCR-za ugotavljanje št.kopij pri normalnih in mutiranih alelih, digestija DNA z dvema restrikcijskima encimoma: eden od njiju je metilacijsko občutljiv, možnost ocenitve velikosti tripletov in analiza metilacije.

Friedrichova ataksija 1/50000-najpogost.oblika dednih ataksij(50%vseh), avtsomalno rec.ded., je posledica šrevilnih ponovitev GAA(96%) trinukleotidov v obeh alelih 9q(9q13)(normalni alel=7-34 ponovitev, nosilci premutacije=36-100ponovitev, bolezenski aleli=več kot 100 ponovitev)-en alel zato podaljšan drug normalen, notranja mitoh.membrana izgubi fratraksin-moten je prenos Fe-zaradi kopičenja Fe se v matriksu poveča pretvorba H2O2 v OH-okvari mtDNK in proteinov; ataksije, nevropatije, kardiomiopatije, skeletne nenormalnosti; bolezen se pojavi ponavadi pred 25 letom, težave z govorom, zmanjšani refleksi, skolioza, deformacije stopal, srčne težave
HUNTINGTONOVA BOLEZEN (HD)
-autosomno dominantna neurodegenerativna bolezen; 1/25 000
-atrofija neostratuma v možganih, bolezen se pojavi v srednjih letih-motorične nepravilnosti, izguba kognitivnih sposobnosti, vedenjske in psihične spremembe, sprememba osebnosti, postopna izguba zavedanja; 1/3 jih ima psihične nepravilnosti, 2/3 pa kombinacijo kognitivnih in motoričnih motenj, zdravljenja ni
-anticipacija – starost pojava bolezni se pri prenosu iz generacije v generacijo niža (le če je prizadet oče in ne mati!); delecija enega od HD alelov ne pušča fenotipskih posledic, HD gen je lociran na 4p16.3(200kb) 
-ekspanzija CAG ponovitev v prvem eksonu, ki kodirajo polyglutamin, prizadeti imajo 36-120 ponovitev CAG; tvorijo se dolge poliglutaminske molekule, napake v zvijanju proteinov, nastajajo agregati
-otrok ki ima enega od staršev z mutacijo ima 50% rizik, da bo bolan, razen tisti z nepopolno penetranco (36-41 ponovitev). 3%rizik pri otrocih z očetom, ki je nosilec premutacije, da bo gen mutiral naprej; zelo redko »de novo« oblike.

MIOTONIČNA DISTROFIJA
-autosomna dominantna mišična distrofija; 1/8000
-mila(pojavi se v poznih letih, katarakta, mišice niso ali so le rahlo prizadete), klasična(pojavi se v zg.srednjih letih,miotonija, mišice atrofirajo) in prirojena oblika(pojavi se ob rojstvu, generalizirana hipoplazija mišic, težja umska prizadetost)
-miotonija, izguba mišic, hipotonija, zaostajanje v motoričnem razvoju, mentalna retardacija, slabost obraznih mišic, katarakta, degeneracija retine, atrofija testisov(zmanjšana spermatogeneza,kljub temu fertilni), zmanjšana reproduktivnost pri ženskah(splavnost), moška plešavost, pogost diabetes.
-amplifikacija CTG ponovitev v DMPK genu(19q13) – protein kinaza
-v izvoru je skoraj vedno maternelna, značilna je anticipacija:starši milo prizadeti-otroci bolj

HERIDITIRANA MIŠIČNO-SENZORNA NEUROPATIJA (HMSN)
-autosomno dominantno dedovanje
-Charcot-Marie-Tooth (genetsko heterogena bolezen); CMT-A1 in HNPP
-mutacije v genu PMP22 (membranski glikoprotein)
-mikrodelecije, mikroduplikacije; delecije ali duplikacije zaradi nepravilnega crossing-over v področju ponavljajočih se sekvenc
-demielinizacija perifernega živčevja, oslabelost mišic in atrofija, deformacija stopal
-HNPP – heriditary neuropathy with liability to pressure palsis; ohromelost; PMP22 delecija, točkasta mutacija

DUCHENNE-OVA MIŠIČNA DISTROFIJA (DMD)
-X-vezano dedovanje; 1/3300 novorojenih dečkov
-mutacije v genu za distrofin (nefunkcionalen protein)
-BMD (Backerjeva mišična distrofija) = lažja oblika DMD
-najpogostejše so delecije, njihova razporeditev ni slučajna, v klasterjih (hot spots)
-visoka stopnja mozaikov v spolnih celicah















CISTIČNA FIBROZA (CF)
-autosomno recesivno dedovanje; prizadet transport epitelnih ionov
-CFTR gen = transmembranski regulatorni gen za transport kloridnih ionov (7; delecija treh baznih parov povzroči izpad fenilalanina – ΔF508) -zaščita pred kolero, selektivna prednost heterozigotov
-fenotip: najbolj so prizadeta pljuča in eksokrini pankreas, najpomembnejša diagnostična značilnost je porast koncentracije Na+ in CL- à CL- ne prehajajo v zračne poti, zmanjšan prehod Na+ in s tem tudi H2O
-mukoza vsebuje manj vlage in je gosta in debela à zaradi debele sekrecije in kasnejše infekcije se razvije kronična obstruktivna pljučna bolezen, pomanjkanje pankreatičnih encimov (lipaza, tripsin, himotripsin) à onemogočena normalna prebava, obstrukcija tankega črevesja, moška infertilnost, slabo delovanje potnih žlez, mašenje žolčnih in jetrinih vodov, slan pot, otroci težko pridobivajo na teži
-gen in CFTR protein: gen za cistično fibrozo se nahaja na kromosomu 7q31 à vsebuje 250 kb DNA à 27 eksonov, gen kodira velik integralni membranski protein, velik 170 kD – CFtr (CF transmembrane conductance regulator) protein – spada v družino ABC transportnih proteinov
-CFtr Cl- kanal ima 5 podenot: 2 membranski podenoti (MSD – membrane spaning domain); 2 nukleotidni (ATP) - vezavni podenoti (NBD); regulatorna podenota (R) – več fosforilacijskih mest
-pora Cl- kanala je sestavljena iz 12 transmembranskih segmentov ATP se veže na NBD podenoto à se hidrolizira à energija, ki se sprosti se porabi za transport ionov
-fiziološke nenormalnosti najbolje razložene na žlezi znojnici: Cl- v kanalu žleze znojnice ne more iz lumna skozi celico in nato v kri à ni elektrokemijskega gradienta, ki normalno služi za vstop Na+ skozi apikalno membrano:↑ kon. Na+ v lumnu žleze; sol je ujeta, kar povzroča gost mukus
-mehanizmi disfunkcije proteina:1.defekt v produkciji proteina à prezgodnji stop kodoni ali mutacije, ki dajejo nestabilne RNA, 2.defekt v procesiranju proteina, ki vodi v nepravilno zvitje à ne zvije se normalno in tako ne more zapustiti ER, 3.-prekinitev regulacije proteina à mutacija v R podenoti, 4.locirane v MSD à defekt v Cl- prevodnosti
-CF prizadene večinoma kavkazijce
-prednost heterozigotov à preživeli kolero (pri kateri človek umre, ker ne more zadržati vode, nenadzorovana prehajanje Cl- à pri heterozigotih težje izločajo Cl- zato so na nek način odporni proti koleri) CFTR deltaF508 na enem alelu gena naj bi v določenem času varovala pred kolero
-druge heterozigotne prednosti:srpasto celična anemija (malarija), receptor CCR5 (HIV)
-POZICIJSKO KLONIRANJE: leta 1986 so z analizo genetske vezave odkrili, da je tesno vezan na RFLP označevalec na daljši ročici kromosoma 7, lahko so začeli z fizičnim kartiranjem gena, kar je trajalo skoraj 3 leta. Leta 1989 so mu določili cDNA in genomsko sekvenco(struktura gena). Analizirali so 330 različnih RFLP označevalcev in eden med njimi D7S15 je pokazal na vezavo na dolgo ročico kromosoma 7. Dva dodatna označevalca sta pokazala tesnejšo vezavo s CFTR genom; met in D7S8 toda bila sta še vedno 1600kb parov narazen. Z dodatno analizo genetske vezave pri še več družinah so uspeli področje zožiti še na približno 500kb. Mesto fizičnega kartiranja se je ujemalo z analizo genetske vezave. Sonda je imela CpG bogate otočke na začetku kodirajoče sekvence. Gen je bil potrjen tudi z Northern blotom (uporabili so RNA, ki so jo izolirali iz tkiva žlez znojnic.

FAP(družinska adenomatozna polipoza)
-incidenca 1/10000, 100 do več 1000 adenomov do pubertete, tveganje za raka: širokega črevesa, želodca, dvanajstnika, tankega ćrevesa, trebušne slinavke,… 7% tveganje za CRC do 21.leta; 93% do 50.leta, avtosomno dominantno: mutacije v genu APC, variante: Grdner,Turcot

Atenuirana FAP(AFAP)
-20 do 100 polipov, običajno v začetnem delu, kasnejši nastanek kot pri FAP, povprečno pri 50.letih, tveganje za CRC=80%, tumorji na drugih organih se pojavljajo z enako pogostostjo kot pri FAP, varianta FAP, mutacija v genu APC, mutacije v glavnem v eksonih 1-5 in na sredini eksona 15 gena APC, možno mutacijsko specifično testiranje družinskih članov z znano mutacijo v genu APC, testiranje gena APC lahko potrdi diagnozo.

Sindrom MAP(multipla adenomatozna polipoza)/gen MYH
-avtosomalni recesivni, mutacije v genu MYH, povprečno št.polipov=55, povprečna starost ob diagnozi= 30-50 let, polipi so majhni, zmerno displastični tubularni adenomi, 30% oseb s 15-100 polipi ima homozigotne mutacije v genu MYH, genetsko testiranje v primeru če je več kot 15 polipov(in ni najdene mutacije v genu APC).





Družinska juvenilna polipoza(FJP)
-manj kot 1% vseh primerov CRC, avtosomalno dominantno, 5 ali več juvenilnih polipov v širokem črevesu ali GI, pojavi se v prvi ali drugi dekadi, 50% tveganje za CRC;AOO v 30, povečano tveganje za raka želodca, GI ali pankreasa, prbl.50% bolnikov ima mutacijo v genu SMAD4 ali BMPR1A.
-kateri geni povzroćajo FJP?:
                        -Heterogena bolezen: 15-20% mutacij se nahaja v SMAD4, 25-40% se nahaja v BMPR1a, ostali vzroki so neznani.
                        -SMAD4,citosolni prenašalec v poti TGF-beta, BMPR1A, receptor tipa 1 za TGF-beta

Imunogenetske bolezni:

Huda kombinirana imunska pomanjkljivost SCID(severe combined immunodeficiency)(bubble boy disease):
-bolniki nimajo B,T;NK celic zato imunski sistem ni razvit-so zelo občutljivi na vsakršno infekcijo
-na X kromosom vezana SCID: receptorji citokinov in rastnih faktorjev so zgrajeni iz alfa,beta in gama podenot oz.kombinacij posameznih podenot. Zapis za te podenote najdemo na kromosomih 10,22 in X. nakromosomu X je zapis za podenoto gama. Ta podenota je sestavni del receptorje za IL-2,4,7,9 in 15. Z okvaro receptorja za IL-2 odpove signaliziranje,ključno za proliferacijo in razvoj ostalih celic imunskega sistema. Z IL-2 naivne celice T po srečanju z Ag na površini APC signalizirajo ostalim T celicam, da se diferencirajo v Th, natačneje v podskupini Th1, ki aktivira makrofage, in Th2 ki aktivira celice B, da izločajo protitelesa.

ADA(pomanjkanje adenozin deaminaze)
-adenozin deaminza je encim, ki pri razgradnji purinov deaminira adenozin do inozina, ta pa se potem prek hipoksantina in ostalih razgradnih produktov izloči iz telesa
-adenozin nastane iz AMP; če se adenozin ne pretvarja v inozin, se AMP nabira in prek drugih nukleotidnih intermediatov inhibira ribonukleotid reduktazo(RNR)m ki je potrebna za nastanek deoksi oblik nukleotidov (gradniki DNA)
-motena sinteza DNA in posredno razvoj limfocitov T.

Avtoimunske bolezni:

HASHIMOTOV TIROIDITIS
-progresivna avtoimunska bolezen ščitnice z limfocitno infiltracijo in antitiroidnimi protitelesi v krvi
-protitelesa delujejo proti številnim proteinom ščitnice (npr. tiroglobulin, tiroidna peroksidaza), in vplivajo na prevzem joda s strani ščitnice. Sledi zmanjšana tvorba hormonov ščitnice (hipotiroidizem). Tdth celice povzročajo intenzivno infiltracijo limfocitov, makrofagov in plazmatk v žlezo. Posledično nastanejo limfolitični vezikli, vnetni odgovor pa je rezultat povečanja organa.

SLE(sistemski lupus eritematozus)
-kronično, avtoimuno obolenje, ki povzroča vnetje različnih delov telesa, najpogosteje kože, sklepov, krvi in ledvic. 90% obolelih je žensk. Sistemski lupus erit.je sistemska bolezen veziva zlasti mlajših žensk, pri katerih avtoprotitelesa in imunski kompleksi poškodujejo lastna tkiva.
-tri različne oblike: diskoidno,subakutno in sistemsko. Najpogostejša je sistemska(70%) in ima tudi najvišjo stopnjo umrljivosti.
-videz metulja na ličnicah-rdeči izpiščaji v obliki metulja.
-diagnostika: prisotnost vsaj 4 od 11 kriterijev ACR: izpuščaj na ličnicah,diskoidni izpuščaj, občutljivost na svetlobo, ustne razjede, artritis, proteinurija, nevrološki znaki, pleuritis/perikarditis, krvne spremembe, imunološke spremembe, pozitivni test ANA(anti nuclear antibody): najbolj značilna za SLE so anti-dsDNA, najti je mogoče tudi protitelesa, ki so značilna za ostala obolenja(protitelesa proti centromeram, RNP, delu topoizomeraze I…)

WAARDENBURGOV SINDROM:
-mutacija Pax3 gena-izraža se tekom razvoja nevralne cevi in dermatomiotomalnih komponentah somitov, širok palec in prsti na nogi
-Heterozigoti za mutacijoPax3 gena:
-Waardenb.sindrom tipa I: redukcija oz.pomanjkanje struktur, ki naj bi se razvile iz nevralne cevi (melanocite v laseh, očeh in notranjega ušesa)
-Waardenb.sindrom tipa II: mutacija v genu MITF (mikroftalmija transkripcijski faktor)
-Waardenb.sindrom tipa III: dodatno še okvare zgornjih ekstremitet.







TEHNIKE:

Southern blot
-je metoda za anlizo DNA, ki je bila cepljena z restrikcijskim encimom. Najprej iz celice izoliramo DNA, nato jo cepimo z restr.encimom, te fragmente z agarozno elektroforezo razvrstimo po velikosti (majhni fragmenti potujejo hitreje od večjih, fragmenti so označeni s fluorescenčnim barvilom. Potek: denaturiramo vijačno DNA z močno bazo, nato to enoverižno DNA prenesemo iz gela na nitrocelulozni papir s kapilarnim prenosom. Sondo in papir skupaj inkubiramo v pogojih, ki olajšajo tvorbo dvojnovijačne DNA. Zmes očistimo, da odstranimo nevezane sonde in nato filter izpostavimo radioaktivnim žarkom.
Uporaba: za odkrivanje velikih sprememb v DNA(veliki odseki, razlike v restrikc.mestu), analiza rekombinantnih klonov in genoma, ali je gen v genomu del večgenske družine in kako so podobni geni organizirani pri različnih vrstah, zaznava: pri (od)sotnost gena, polimorfizem,pomnožitev gena, kromosomsko translokacijo; ne zaznava majhne mutacije!

Hibridizacija po Southernu:
-razcepitev DNA z restrikcijsko endonukleazo-ločitev odsekov DNA na agaroznam gelu-prenos DNA na membrano(nylon,nitroceluloza)-zaznava določene sekvence z označeno sondo
-zazna velike razlike v odsekih DNA; zazna razlike v restrikcijskem mestu, zazna prisotnost gena, spremembo v sekvenci(polimorfizem), povečano št.kopij gena, gensko preureditev(kromosomska translokacija)
-Southern blot=filter, na katerega je bila prenesena DNA, navadno po restrikcijskih encimih in elektroforezi, da bi se molekule razdelile po velikosti.

Analiza z alel specifičnimi oligonukleotidnimi sondami (ASO)
-metodo uporabljamo, če imamo npr. neko mutacijo pri določenih boleznih in hočemo ugotoviti ali je mutacija pri nekem pacientu prisotna ali ne
-uporabimo alel-specifično oligonukleotidno sondo à primerna za detekcijo mutacij posameznih baz, saj je njena kratka dolžina občutljiva za mutacije posameznih baznih parov
-z analizo Southern blot s kloniranimi DNA sondami ne moremo zaznati sprememb v posameznih bazah, razen če sprememba uniči mesto restrikcijskega encima blizu regije komplementarne sonde à v tem primeru zazna spremembo v velikosti fragmenta
-ASO analiza omogoča natančno identifikacijo določene DNA sekvence in lahko loči med posamezniki, ki imajo normalno DNA sekvenco na obeh kromosomih, na tistih, ki imajo mutirani obe sekvenci na kromosomih in tistih, ki imajo eno normalno sekvenco na enem kromosomu in mutirano sekvenco na drugem. ASO analiza se najpogosteje uporablja v primeru, kjer velja velika verjetnost, da ima posameznik ali družina neko znano mutacijo


Northern blot
-je metoda za analizo vzorcev RNA na osnovi razlik v dolžini RNA transkriptov. RNa ločimo z agarozno elektroforezo po velikosti, jo prenesemo na nitrocelulozni papir, filter denaturiramo in z označeno sondo inkubiramo,da poteče hibridizacija,nato izpostavimo x-žarkom in določimo pozicijo posameznega transkripta.
Uporaba: analiza izražanja genov v različnih tkivih, opazovanje regulacije izražanja genov v različnih stopnjah razvoja organizma.

In situ hibridizacija kromosomov
-DNA je v stanju metafaze fiksirana na podlago in denaturirana na mestu-nastaneta 2 veridi DNA, ki omogočata označeni sondi, da se hibridizira s kromosomsko DNA. Če je na sondi fluorescenčno barvilo, je to FISH:tehnika fizičnega mapiranja, pri čemer se uporabljajo DNA sonde, ki so označene z markiranimi molekulami; DNA sonde iščemo pod fluorescenčnim mikroskopom, jih slikamo in analiziramo.
Uporaba FISH: prenatalna diagnostika(aneuplodije), subtelomerne kromosomske spremembe, za mikrodilecijske sindrome, rak (levkemije), analiza numeričnih in strukturnih preureditev, za diagnozo tudi interfazna jedra.
vrste DNA sond
-sekvenčno specifične DNA sonde – označena določena DNA sekvenca ali gen
-WCP (Whole chromosome paint) – označi se celoten kromosom; dobimo specifično sekvenco za en sam kromosom iz z večjo maso teh sekvenc dobimo sondo; predstavljajo skupek fragmentov, ki krijejo celoten kromosom
-multicolor FISH – kombinacija 25 barv, sestavljenih iz 5 fluorescenčnih barvil; kamera jih zazna kot različne odtenke sivin
-FISH tehnika je tudi SKY (spectral karyotyping) – 24 različno obravanih sond (eno za vsakega izmed 24 človeških kromosomov) à te kromosomsko specifične sonde dobimo z ločitvijo vsakega kromosoma na bazi velikosti in vezavni karakteristiki; vsak DNA vzorec je označen z različno kombinacijo barv, ki oddajajo različne valovne dolžine; vseh 24 sond se skombinira in uporabi za FISH metafaznih kromosomov

PCR
-PCR je alternativa kloniranju za ustvarjanje neomejenga števila sekvenc, ki jih potrebujemo
-je encimsko pomnoževanje fragmenta DNA med dvema oligonukleotidnima primerjema à en primer je komplementaren eni verigi DNA, drugi pa drugi verigi na nasprotni strani; vsak oligonukleotid hibridizira s svojo verigo toplotno denaturiranega fragmenta DNA, tako da sta njuna 3' konca obrnjena drug proti drugemi à DNA polimeraza zato sintetizira del DNA, ki je med obema oligonukleotidoma
-en krog reakcije verižne polimerizacije je iz 3 stopenj:
1.         z visoko T denaturiramo matrično DNA (komplementarni verigi se ločita)
2.         T reakcijske zmesi znižamo pod T tališča vezave obeh oligonukleotidov
3.         dvignemo T na optimalno območje za delovanje encima DNA-polimeraze
-v reakcijski zmesi imamo: DNA, dNTP, DNA polimeraza, začetni oligonukleotidi (primerji), v primeru kodirajoče DNA tarčne sekvence je lahko začetna DNA pogosto cDNA, ki jo pripravimo iz izolirane RNA (à v DNA jo pretvorimo z encimom reverzna transkriptaza)
PCR metode:
-alel specifični PCR – pomnoži neko določeno DNA sekvenco in izključi možnost za pomnoževanje drugih alelov
-''touch down'' PCR – povečana specifičnost PCR reakcije, pri vsakem ciklu zmanjšamo T za 1°C, da bi zadeli optimalno T
-''hot start'' PCR – pri začetni denaturacijski temperaturi (↑T) zmešamo vse PCR reagente à več možnosti za nespecifično vezavo primerjev; da zmanjšamo možnost za nespecifično vezavo, še pred prvim korakom eno ali več komponent ločimo
-''nested primer'' PCR – produkte začetne pomnožitvene reakcije razredčimo in jih uporabimo kot začetno DNA za drugo reakcijo, kjer uporabimo druge primerje
-Alu PCR – uporabimo primer, ki je specifičen za Alu zaporedja – sekvence, ki se pojavijo na vsake 3 kp pri človeški DNA; če sta sosednji Alu ponovitvi orientirani v nasprotni smeri, posamezen Alu primer podvojuje vmesno sekvenco
-inverzni PCR – začetno DNA razrežemo z restrikcijsko nukleazo, jo razredčimo in izpostavimo DNA ligazi, da pospešimo tvorbo krožne DNA; vezava primerjev à začetek sinteze nove DNA v smeri stran od poznane sekvence in proti neznani sosednji sekvenci à pomnoževanje neznane sekvence
-RT-PCR (PCR z reverzno transkriptazo) – začetna populacija je mRNA; da dobimo cDNA potrebujemo reverzno transkriptazo
-''real-time'' PCR – PCR v realnem času (kvantitativni PCR); uporabimo fluorescentne probe; pomnožujemo specifične sekvence nukleinskih kislin in hkrati mešamo njihove koncentracije; za pomnožitev genske ekspresije ter za iskanje mutacij in polimorfizmov posameznih nukleotidov
-PCR v celotnem genomu – uporabimo vsestranske, degenerirane primerje ali vežemo oligonukleotide na DNA populacijo in nato uporabimo specifične oligonukleotidne primerje, da pomnožimo vse sekvence
Uporaba PCR
direktno določevanje nukleotidnega zaporedja DNA, brezpredhodne stopnje vgrajevanja v plazmid; analiza zelo majhnih količin nukleinskih kislin; kloniranje fragmentov DNA in manupulacija nukleotidnega zaporedja fragmenta; lažja analiza genskih prepisov; analiza organizacije genov, kadar poznamo nukleotidno zaporedje cDNA; določevanje relativnih količin neke določene mRNA v določenem vzorcu (kvantitativna PCR metoda); forenzične preiskave za identifikacijo oseb

CGH(komparativna genomska hibridizacija)
-je metoda za ugotavljanje presežkov in primanjkljajev v genomu. Gre za primerjavo intenzivnosti barvil, ko zdrave kromosome pobarvamo z eno in nezdrave z drugo. Če je odstopanje od razmerja 1:1 potem je nezdrav kariotip (pomik v zeleno-amplifikacija; pomik v rdečo-delecija). Ne omogoča pregleda uravnoteženih sprememb. Ne omogoča identifikacijo uravnoteženih kromosomskih sprememb
Čip(mikroraster)
-je razvrstitev številnih sond(več 1000 ali 10000) kratkih odsekov DNA oz. oligov velikosti med 20 in 60 nukleotidov na kativni površini. Te sonde so pritrjene na površino majhnega stekelca v urejeni mreži točk. Vsaka točka vsebuje več kopij oligonukleotida, na osnovi katerega lahko identificiramo posamezen gen.
Uporaba: funkcionalna genomika: določitev vloge genov, za odkrivanje biomarkerjev:izvor,prognoza, napoved bolezni, farmakologija:za ugotavljanje razlik v ekspresijskih profilih na različne doze zdravilnih učinkovin, toksikogenomika: odkrivanje potencialnih neželenih učinkov pri ljudeh.
MICROARRAY CGH (čip tehnologija)
-resolucija se poveča; hibridizacije ne izbajamo na kromosome, ampak na čipe; omogoča pregled celotnega genoma, odkrivanje delecij in amplifikacij; pri array CGH čipih se namesto metafaznih kromosomov uporabljajo genomske BAC-s s plazmidi, kozmidi ali cDNA kloni; čip tehnologija lahko odkriva in meri gensko ekspresijo na nivoju mRNA ali proteinov; osnovni princip: vezava makromolekul na čip, označevanje vzorcev s fluorokromi, hibridizacija, računalniška analiza







Metode, ki temeljijo na sekvenciranju:
-so hitre (denaturating high performance liquid chromatography – dHPLC), poceni (single strand confirmation polymorphisms – SSCP), daje neko posebno informacijo (kvantitativni PCR)
-dajejo več informacij od drugih metod; poročajo o razliki med testno in standardno sekvenco, ter so dobre kvalitete
-dHPLC à hiter, kvantitativen; drag, ne odkrije mesta spremembe
-SSCP à poceni, enostaven; detekcija sekvenc < 200 bp, ne odkrije mesta spremembe

HPLC(high performance liquid chromatography)
-ločuje komponente zmesi z uporabo kemičnih interakcij med snovmi in kromatografsko kolumno.

DHPLC(DNA fragment analysis system)

SSCP
-je postopek analize enoverižnih konformacij DNA. Nejprej pomnožimo izbrano sekvenco DNA s PCR. Wild-type in mutirani gen denaturiramo, pomešamo in inkubiramo, da se genski material hibridizira, nastanejo homo in heterodupleksi,ki jih ločimo z gelsko elektroforezo.

Metode, ki temeljijo na prepoznavanju heterodupleksov in nepravilnih parjenj:
-veliko testov uporablja lastnosti heterodupleksov za zaznavo razlik med dvema sekvencama
-večina mutacij je heterozigotne oblike; heterodupleks naredima tako, da segrevamo heterozigotni testni PCR produkt, da denaturira in ga nato počasi ohlajamo
-lastnosti heterodupleksov: nenormalna mobilnost na poliakrilamidnem gelu; če testirani fragmenti niso večji od 200 bp lahko zaznamo insercije, delecije in nekatere single-base substitucije; imajo nenormalni denaturacijski profil – zo izkoriščata dHPLC in DGGE (denaturating gradient gel lecrtophoresis – potrebni posebni primerji), saj se mobilnost fragmentov ob denaturaciji spremeni; nepravilno parjene baze so v heterodupleksu občutljive na cepljenje s kemikalijami ali encimi
-metoda DGGE je izjemno natančna à določanje mutacij posameznih baznih parov; divji tip in mutirana DNA migrirata z različno hitrostjo na gelu, ker imata različno talilno temperaturo
-DHPLC – tehnika za detekcijo heterodupleksov; dva DNA (pomnoženi s PCR) se razlikujeta v enem nukleotidu à segrevamo à tvorita heterodupleks, ki ga lahko ločimo z HPLC; detekcija heterozigotov in SNP alelov

DGGE(denaturacijska gradientna gelska elektroforeza)
-denaturant narašča oz.narašča njegova koncentracija, če mutacija daje bolj stabilen dupleks je potrebna višja koncentracija za denaturacijo, heterodupleks z nesparjenim baznim parom-nesparjen par destabilizira heteroduplekse

Sangerjeva metoda
-uporabimo dideoksinukleotid trifosfate (ddNTP) – nimajo 3-OH in 2-OH skupine, zato se DNA polimeraza, ko naleti na dDNTP ustavi
-za vsako bazo drug ddNTP à ddATP – ustavi se pri A à dobimo segmente različnih dolžin, ki jih nato ločimo z gelsko elektroforezo ter obarvamo, da postanejo vidni
-metodo uporabljamo za določanje aminokislinske sekvence nekega gena, da bi ugotovili, če so prisotne posamezne mutacije in genske bolezni

Western blot
-filter, na katerega so bile prenesene proteinske molekule po gelski elektroforezi, da bi se molekule razdelile po velikosti.
-daje nam informacijo o velikosti in količini mutiranega proteina
-proteine izoliramo iz celice in jih nato z gelsko elektroforezo ločimo po velikosti à prenesemo jih na membrano, jih inkubiramo s protitelesi, ki prepoznajo želene proteine (interakcijo med protitelesom in njegovim genom lahko ugotovimo z drugim protitelesom) à ga radioaktivno ali fluorescentno obarvamo
-tehniko uporabljamo pri identifikaciji X vezane mišične distrofije (preotein distrofin)

SKY(spectral kariotyping)
-ločevanje barv po spektralni emisiji po posameznih pikslih; kariotipizacija
-molekularna citogenetska tehnika, ki jo uporabljamo za simultano vizualizacio vseh parov kromosomov organizma v različnih barvah, uporablja se za identifikacijo strukturnih aberacij kromosomov in rakastih celic ter drugih bolezni, ko ostale tehnike niso dovolj natačne.

MLPA (multiplex ligation dependent probe amplification)
-metoda za določanje napak velikih delecij ali duplikacij; kvantitativno pomnoževanje DNA vsakega eksona; določamo incidenco št. kopij genov za predispozicijo raka (analiziramo MLH1 in MSH2 pri pacientih z dednim nepolipoznim kolorektalnim rakom; BRCA1 in BRCA2 pri družinah z dednim rakom dojke ali ovarijev) -metoda je namenjena odkrivanju srednje velikih sprememb velikostnega reda enega gena oz. dela gena, temelji na hibridizaciji sond s tarčno DNA, v eni multpli PCR reakciji omogoča istočasno zaznavo sprememb v številu kopij 40 genomskih DNA zaporedij.
-osnova MLPA reakcije: denaturirano genomsko DNA hibridiziramo z mešanico(40 sond), vsaka MLPA sonda je sestavljena iz 2 oligonukleotidov, enega sintetičnega in enega sintetiziranega v fagu M13. Obe polovici sonde hibridizirata na sosednji tarčni zaporedji, povežemo ju s termostabilno ligazo. Vse ligacijske produkte pomnožimo s pomočjo univerzalnega para začetnih oligonukleotidov; pomnožek vsake izmed sond ima drugačno dolžino(130-480bp)
Metilacijsko specifična MLPA:
-modificirana MLPA reakcija se uporablja za analizo statusa promotorjev genov; sestava sond za zaznavo metilacijskega statusa promotorja z reakcijo MLPA je enaka kot pri klasični MLPA reakciji. Razlikujejo se le tarčna zaporedja oligonukleotidov, ki na stiku obeh polovic sonde vsebujejo restrikcijska mesta metilacijsko specifičnih encimov Hpall in Hhal. Če je restrikcijsko mesto na stiku obeh polovic sond metilirano, ga encim ne more rezati, zato sondo po ligaciji v koraku PCR reakcije pomnožimo in na elektroferogramu se pojavi vrh.

RFLP(polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov)
-za določitev teh verig najprej razrežemo genomsko DNA dveh osebkov z restrikcijskim encimom, naredimo Southern blot in na različno dolgih odsekih DNA iščemo s sondami razlike v sekvenci (razlike v sekvenci nam dajo različne vzorce.








TRDITVE pravilne:
- Dvojno vijačnico DNA molekule sestavljata dve verigi, ki potekata antiparalelno. Orientacijo posamezne verige določa smer fosfodiestrskih vezi v posamezni verigi.
-Hidroksilacija prolina je primer posttranslacijske modifikacije proteinov, pri kateri igra pomembno vlogo vitamin C in ki omogoči, da protein kolagen dozori in normalno deluje.
-Pri delovanju Lac operona ima pomembno tudi represorski protein, ki inhibira delovanje proteinov Lac operona, ko je v okolju bakterije zadosti hrane (glukoze).
-Acetilirani histonski proteini so značilni za gene, ki se izražajo. DNA je bolj dostopna za prepisovanje, ker je pozitivni naboj lizinskih aminokislin iz histonov nevtraliziran in je vezava negativno nabite DNA na histone manj trdna.
-Telomere so specifična zaporedja ponovitev nukleotidov na koncih linearnih evkariontskih DNA molekul, ki preprečujejo izgubo informacije ob procesu replikacije.
-Z vezavo zaporednih molekul ubikvitina se določen protein  označi za razgradnjo v proteasomu. Ko število vezanih molekul ubikvitina preseže 3, se verjetnost za razgradnjo proteina zelo poveča.
-Dolžina poli(A) repa zrele mRNA molekule se približno ujema z njeno življenjsko dobo, kar pomeni, da se mRNA z večjim številom dodanih adeninov večkrat prevede in sintetizira več proteina.
-Sinteza vseh proteinov se začne z enakim kodonom AUG, ki kodira aminokislino metionin.
-Med pomembne vzroke za razgradnjo novo sintetiziranega proteina štejemo stanje, ko protein ne dosežepredidene terciarne strukture kljub delovanju pomožnih proteinskih molekul za zvijanje proteinov – chaperonov.
TRDITVE napačne:
-Genetska koda je degenerirana, kar pomeni, da različni kodoni kodirajo različne aminokisline. Enak kodon lahko ustreza različnim aminokislinam, medtem ko enake aminokisline niso povezane z različnimi kodoni.
-Kovalentna modifikacija metilacija je značilna samo za DNA molekule, ker je pomemben mehanizem uravnavanja izražanja genov, medtem ko se RNA molekule ne metilirajo.
-Stop kodon je signal za RNA polimerazo, da prekine prepisovanje gena, ker je dosegla konec gena.
-Acetilirani histoni in metilirana DNA sta značilnost gena, ki se ne izraža.
-Pri oblikovanju zrele evkariontske mRNA molekule se izrežejo eksoni, da se lahko introni zlepijo v enovito verigo z odprtim bralnim okvirjem, doda se 5' kapa in 3' poliadeninski rep.
-Operon je proteinski kompleks, sestavljen iz več proteinov, ki v celici vrši zapleten večstopenjski proces. Posamezne proteinske podeonote katalizirajo zaporedne stopnje procesa.
-Protein XYZ sestavlja 215 aminokislin, zato lahko predpostavimo, da gen, ki ga kodira sestavlja 645 kodonov oz. 215 baznih parov.
-Odprt bralni okvir sestavlja število nukleotidov, ki je večkratnik števila 3, ter se začne z enim izmed treh stop kodonov in konča s kodonom za aminokislino triptofan.
-Antikodon je mesto na tRNA molekuli, kamor se veže aminokislina. Specifično zaporedje nukleotidov antikodonske zanke prispeva k prepoznavanju aminokisline.
-Dejavnike, ki vplivajo na izražanje genov delimo na cis elemente, proteine, ki se vežejo v bližino promotorja in na trans elemente, nukleotidna zaporedja, oddaljena od promotorja gena, vendar večinoma na istem kromosomu, kot gen, na katerega vplivajo.
-Fibroblast človeka se od celice E. coli razlikuje po tem, da so samo proteini katalizatorji reakcij v procesih, medtem ko v bolj primitivni bakterijski celici pomemben del katalize izvajajo tudi različne -RNA molekule.
-Utišanje gena je proces, pri katerem se izražanje genov ustavi tako, da se ti geni v procesu rekombinacije izrežejo in odstranijo iz kromosoma.
-RNA polimeraza začne proces prepisovanja z vezavo na promoter gena specifičnega zaporedja nukleotidov, ki se nahajajo pred genom. Pri tem točen začetek sinteze mRNA ni vezan na startni kodon, ker se vedno prepiše še nekaj predhodnih nukleotidov.
-DNA polimeraza je tudi eksonukleaza in je sposobna razgradnje fosfodiestrske vezi. Odstranitev nukleotidov v smeri 3'-5' je eden od mehanizmov za popravljanje napak po sintezi DNA verige.
-Molekule RNA se od molekule DNA razlikuje v vrsti sladkorja, organski bazi, kar preprečuje oblikovanje dvojne vijačnice.
Imprinting=kompleksno dogajanje genskega uravnavanja, v katerem se izrazi le ena od starševskih kopij gena in je neodvisno od mendelskega dedovanja. Proces poteka preko metilacije DNA in ima ključno vlogo v embriogenezi in razvoju ploda oz.fetusa.
ZINK finger: majhni strukturni proteini, ki lahko koordinirajo enega ali več cinkovih ionov in jim pomagajo pri stabilizaciji njihovih gub/zavojev. Lahko jih klasificiramo v številne različne strukturne družine. Tipično delujejo kot interakcijski moduli ki vežejo DNA,RNA,proteine ali majhne molekule. Koordinirajo cinkove ione v koordinaciji z ostanki cisteina in histidina(Cys2His2, Cy4in Cys6).
Mehanizmi nastanka raka:
-TRANSLOKACIJA: kromosomski segment je translociran na drug kromosom,kar ima za posledico aktivacijo izražanja (c-myc), ob translokaciji se lahko formira nov, združen protein (bcr-abl) s spremenjeno aktivnostjo
-POMNOŽEVANJE: s pomnoževanjem onkogena pride do več kopij onkogena, kar vodi v povečano izražanje gena in celično proliferacijo(HER2/neu erbB2)
-TOČKOVNE MUTACIJE: vplivajo na pot signalnih proteinov(povečajo, zmanjšajo njihovo ekspresijo)

Teorija dveh zadetkov: za razvoj tumorjev je potrebna izguba funkcije obeh alelov. Na kliničnem nivoju se sicer kaže kot dominantno dedovanje. Na celičnem nivoju sta potrebni 2 mutaciji za razvoj tumorja. Prva mutacija je lahko podedovana ali somatska. Druga mutacija je somatska.

Knjižnica:
Je zbirka klonov bakterij ali kvasa, ki vsebujejo vektor, v katerem je želeni DNA fragment.
-GENOMSKA KNJ.:človeško genomsko DNA cepimo z restr.encimom(naključno cepljenje) v za kloniranje primerne velikosti in prenesemo v vektor. Ta knjižnica vsebuje 1mil.ali več fragmentov genomske DNA, ki je shranjena za nadaljno izolacijo genov. Naključno cepljena DNA je nato spravljena v bakteriofage(vsak od njih vsebuje drug človeški DNA fragment) in vsi fagi skupaj predstavljajo celotno DNA človeškega genoma.
-cDNA KNJ.: vsebuje kopije cDNA kopije mRNA populacije. Klon je direktna predstavitev kodirane sekvence brez intronov in drugih nekodirajočih zaporedij, lahko se klonirajo mRNa vir genov, ki so prisotni le v določenih tkivih. Vse metode kloniranja cDNA temeljijo na encimu reverzna transkriptaza (je od RNA odvisna DNA polimeraza iz retrovirusov, ki lahko sintetizira cDNA verigo iz RNA vzorca), potrebuje primer za DNA sintezo, enojno zvita cDNA se nato pretvori v dvojno zvito molekulo in se prenese v vektor. Knjižnica cDNA klonov predstavlja vse originalne mRNA transkripte, ki jih najdemo v celici ali tkivu.